澳门新葡亰官网平台_www.301.net_澳门新葡亰手机游戏

热门关键词: 澳门新葡亰官网平台,www.301.net,澳门新葡亰手机游戏

一种鱼类转基因育种方法,生物技术在水产养殖

来源:http://www.vsbeautyhk.com 作者:渔业 人气:143 发布时间:2019-11-22
摘要:澳门新葡亰手机游戏,日前,由我院淡水中心生物技术研究室曹哲明副研究员等人发明的“一种鱼类转基因育种方法”获国家发明专利授权,专利号为ZL2009 1 0183768.6。 核心提示 :日前

澳门新葡亰手机游戏,日前,由我院淡水中心生物技术研究室曹哲明副研究员等人发明的“一种鱼类转基因育种方法”获国家发明专利授权,专利号为ZL 2009 1 0183768.6。

核心提示:日前,由我院淡水中心生物技术研究室曹哲明副研究员等人发明的“一种鱼类转基因育种方法”获国家发明专利授权,专利号为ZL200910183768.6。 中国水产门户网报道 日前,由我院淡水中心生物技术研究室曹哲明副研究员等人发明的“一种鱼类转基因育种方法”获国家发明专利授权,专利号为ZL200910183768.6。 本专利技术通过改造鱼类宿主自身的基因组DNA形成一系列重新排布的DNA碎片,再导入宿主的卵细胞,产生不同的突变体,从中可以选择优良的个体加以选育获得新品种,同时通过一系列技术获得导入的序列进行验证,并转化为特殊标记作为该品系的特异鉴定标记。

中国水产门户网报道目前,我国水产养殖业尤其是虾类、贝类、鱼类受到病原微生物的侵扰十分严重,如何对水产动物疾病进行快速、准确的预报与诊断,是摆在养殖业面前的第一道门坎。近些年来,生物技术的发展已为病原体的检测提供了快速、高效、灵敏的技术手段。1单克隆抗体单克隆抗体是由单个细胞传代所产生的高纯度、高特异性的抗体。它与常规血清抗体相比,具有更强的特异性与针对性,且制备简单,因而在病原检测中得以广泛应用。80年代后期,已成功研制出传染性胰腺坏死病毒、出血病毒等单克隆抗体,并用于鱼类多种疾病的诊断。近年来。有学者已成功制备了抗鳗弧菌的单抗和抗嗜水气单胞菌的单抗。我国在单克隆抗体技术中,将其应用于检测草鱼出血病毒和对虾白斑病毒,均获得了较为2酶联免疫吸附酶联免疫吸附检测是将抗原或抗体吸附在载体表面,通过酶与底物显色来检测特异性抗原或抗体的技术。该技术具有反应迅速、特异性强、灵敏度高等特点。目前,ELISA在鱼类病原体检测上的应用较广,国内诸多学者将此技术用于疾病检测上,如李焕荣等应用Dot-ELISA快速检测出了嗜水气单胞菌的致病因子胞外蛋白酶AhECPase54;黄?应用单克隆抗体酶联免疫技术检测到了对虾皮下及造血组织坏死杆状病毒;陈怀青等应用Dot-ELISA检测到了鱼类致病性嗜水气单胞菌hec毒素。国外对此项技术的研究较国内早,广泛用于对疖疮病、红嘴病、细菌性肾脏病以及爱德华菌病等的快速检测与诊断。此外,Noel等将ELISA用于菲律宾哈上,成功检测出了弧菌PI。满意的效果。3核酸探针核酸探针是指利用特定标记的DNA或RNA探针与病原生物中的与探针互补的靶核苷酸序列进行杂交,以此来确定宿主是否携带病毒的一类分子生物学技术。该方法以其灵敏度高、特异性强、简便快速等特点,在病原检测中倍受青睐。Futo,Hiney将此技术应用诊断细菌性鱼病,Comps等采用地高辛标记的RNA探针检测FEV病毒在鱼类中的表达,Bruce等利用DNA探针检测对虾杆状病毒。日本学者也采用地高辛标记的DNA探针进行菌落杂交,用于鳗弧菌的鉴定。我国学者黄?针对导致我国对虾大规模死亡的病原-皮下及造血组织坏死杆状病毒,已成功研制出核酸探针试剂盒,用于虾病的诊断。该法简便快捷,操作性强,已获国家专利。4聚合酶链反应酶链反应技术是指在引物的指导下,体外酶促反应,迅速扩增DNA片段的一种方法。该法反应十分迅速,几小时内便可扩增到108-10倍,因而PCR技术具有高度的灵敏性。目前PCR在水产动物病原的操作中,已成功应用于毛蛤甲肝病毒,对虾桃拉病毒、的检测白斑病毒等,并研制出了诊断白斑病毒的检测试剂盒,可用于幼虾、成虾以及亲虾的带毒检测,同时还可对养殖环境中的宿主、底质、饵料等进行检测。另外有学者也报道了应用PCR技术检测贝类肠道病毒以及周围水体内的病菌等。5细胞培养当前,动物细胞培养也作为一类技术用于水产动物病原体的检测。如Lu等应用对虾淋巴器官原代培养细胞检测对虾黄头杆状病毒。此外,水产动物细胞培养也可用于筛选抗菌药物、培育新型品种以及生产各类疫苗和免疫制剂等。编辑:龙斌

核心提示:常用的基因转染技术是将外源基因导入靶细胞需要一定的载体和导入方法,基因转技术则是将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内,

本专利技术通过改造鱼类宿主自身的基因组DNA形成一系列重新排布的DNA碎片,再导入宿主的卵细胞,产生不同的突变体,从中可以选择优良的个体加以选育获得新品种,同时通过一系列技术获得导入的序列进行验证,并转化为特殊标记作为该品系的特异鉴定标记。

常用的基因转染技术是将外源基因导入靶细胞需要一定的载体和导入方法,基因转技术则是将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内,并在细胞内表达。转染方法有多种,根据不同的细胞,贴壁或悬浮细所可选用不同的方法,其目的是要达到设置转染效率,影响转染产率的因素有多种,包括转染方法、操作技术、质粒 DNA的纯度、靶细胞的生长状态等,下面重点介绍向几种常用的转染技术: 被用于作靶基因转染的细胞,其生长状态如何,将直接决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细胞,一般要求在转染前一日,必需应用胰酶处理成单细胞悬液,重新接种于培养皿或瓶,细胞密度以铺满培养器皿的60%为宜,转染当日,在转染前4小时换一将近新鲜培养液。对于悬浮细胞,也需在转染前4小时换一次新鲜培养液。 用于转染的质粒DNA必须无蛋白质,无RNA和其了化学物质的污染,OD260/280比值应在1.8以上。应用酚-氯仿抽提法制备的质粒DNA一般难以达到此标准,目前大多采用进口的术提取纯化试剂盒。 具体的基因转染技术有鳞酸钙介导的转染法、DEAE葡聚糖介导转染法、脂质体介导转染法及电击基因转导尘等。靶基因被导入细胞后,一般在转染后48小时,靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的,48小时后即可进行靶基因表达的检测等实验。如若建立稳定的细胞系,则可对靶细胞进行筛选,根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物,最常用的直核表达基因载体的标志物有潮霉素(hygromycin)和新霉素。

常规转染技术可分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-72小时内(依赖于各种不同的构建)分析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白,β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染,外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小,大约1/104转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素B磷酸转移酶,胸苷激酶等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系。转染技术的选择对转染结果影响也很大,许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例,细胞数量,培养及检测时间等。一些传统的转染技术,如DEAE右旋糖苷法,磷酸钙法,电穿孔法,脂质体法各有利弊,其主要原理及应用特点见下表:

转染方法 原理 应用 特点
磷酸钙法 磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞 稳定转染瞬时性转染 不适用于原代细胞操作简便但重复性差有些细胞不适用
DEAE-右旋糖苷法 带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞 瞬时性转染 相对简便、结果可重复但对细胞有一定的毒副作用转染时需除血清
电穿孔法 高脉冲电压破坏细胞膜电位,DNA通过膜上形成的小孔导入 稳定转染瞬时性转染所有细胞 适用性广但细胞致死率高,DNA和细胞用量大, 需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件
病毒介导法 通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中 稳定转染 可用于难转染的细胞、原代细胞,体内细胞等
逆转录病毒 特定宿主细胞 但携带基因不能太大细胞需处分裂期需考虑安全因素
腺病毒 通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中 瞬时转染特定宿主细胞 可用于难转染的细胞需考虑安全因素
阳离子脂质体法 带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞 稳定转染瞬时性转染所有细胞 适用性广,转染效率高,重复性好,但转染时需除血清。转染效果随细胞类型变化大
Biolistic颗粒传递法 将DNA用显微重金属颗粒沉淀,再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞,DNA在胞内逐步释放,表达 瞬时性转染 可用于:人的表皮细胞,纤维原细胞,淋巴细胞系以及原代细胞
显微注射法 用显微操作将DNA直接注入靶细胞核 稳定转染瞬时性转染 转染细胞数有限多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞

;除上述传统方法外,近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术,以其适用宿主范围广,操作简便,对细胞毒性小,转染效率高受到研究者们的青睐。其中树枝状聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)的转染性能最佳,但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性,且其合成工艺复杂。聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子,每相隔二个碳个原子,即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子,使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞,其效果好于脂质聚酰胺,经进一步的改性后,其转染性能好于树枝状聚合物,而且它的细胞毒性低。大量实验证明,PEI是非常有希望的基因治疗载体。目前在设计更复杂的基因载体时,PEI经常做为核心组成成分。线型PEI(Line PEI,LPEI)与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI(Branched PEI,BPEI)要早一些,过去的研究认为在不考虑具体条件,LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低,有利于细胞定位,因此与BPEI相比应该转染效率高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的转染复合物,从而提高转染效率,但同时细胞毒性也增大。超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基,在染实验中发现这种PEI的毒性低,但转染效率却较高。GenEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键的交联剂交联,合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝结构使得其具有较高的正电性,因此易于高效地包裹各种DNARNA分子及质粒形成小的纳米颗粒,从而提高转染效率,当所形成复合物进入细胞以后,其中所含的生理条件下可降解的化学键在细胞内水解,使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI,这样结构的转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性,其可降解性对体内应用也具有重要的意义。

本文由澳门新葡亰发布于渔业,转载请注明出处:一种鱼类转基因育种方法,生物技术在水产养殖

关键词:

最火资讯